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    應用研究
    特異鱟試劑研究進展(綜述)
    Date: 2017-07-19 11:05:38

    夏振民  劉大英
    (中國藥品生物制品檢定所  北京  100050)
     
          自從1981年日本學者Kakinuma A等報道“一種抗癌物質(1-3)-β-D-Glucan 可使鱟試劑凝聚”以來,由于其涉及鱟試的特異性,引起各國學者的注意。經過10多年來的基礎研究與實踐,目前對其本質、來源、與鱟試劑反應機理以及克服方法,已經了解得相當深入。中國特異鱟試劑的研究、生產和實際應用也開始起步,為促進這一工作的發展,將有關文獻報道,簡要綜述如下:
    一、(1-3)-β-D-葡聚糖的本質與來源

          Kakinuma A等在作抗癌物質葡聚糖熱原試驗時,不含發熱物質的葡聚糖能引起鱟試驗呈陽性反應。Loretta A和Pearsen FC也報道,血液透析器上存在鱟試驗反應物質(LAL-Reactive Material LAL-RM),以后有報道凡經過銅銨人造絲透析膜的制品,均存在使鱟試驗陽性,但不是內毒素的物質。除(1-3)-β-葡聚糖外,(1~4)、(1~6)-β-葡聚糖同樣使鱟試驗產生陽性結果,這些物質的總稱為真菌多糖(Fungal polysaccharide),普遍存在于真菌細胞壁。如果這類物質具有像內毒素一樣的致熱活性,細菌內毒素檢查和熱原檢查結果的符合率會接近一致。但是恰恰相反,真菌多糖似乎不是一種致熱物質,文獻報道1.0、0.01、0.0001mg/ml的真菌多糖溶液,劑量按10ml/kg,進行熱原試驗的結果,3h內3只家兔最高升溫的均值分別為0.23±0.03,0.13±0.09,0.20±0.10。這將導致在使用普通鱟試劑檢測某些樣品時,出現細菌內毒素檢查不合格,熱原檢查合格的現象。造成對這些物質熱原檢查的錯判。1990年Ikemura K等將鱟試驗反應機理和各種干擾內毒素檢查物質及干擾部位歸納如圖。


    鱟試劑反應機理和干擾內毒素檢查物質及干擾部位
          
          由此可知,鱟試劑檢測內毒素出現非特異結果是不奇怪的。為了使細菌內毒素檢查與熱原檢查的結果趨向一致,使用特異鱟試劑是完全必要的。
    二、特異鱟試劑制備
          1968年Levin J和Bang F B創建鱟試劑以來,使內毒素的檢測成為靈敏、快速、簡便的方法,已被舉世公認,并被美、日、中、歐洲藥典以《細菌內毒素試驗》收載,但是由于上述非特異性的存在,使這一試驗的實際應用受到一定限制。為了克服這一弊端,各國學者進行了深入研究。由于上述鱟試驗反應機理已被闡明,設法阻止右側旁路反應,便能使鱟試劑對內毒素的檢測達到特異性的目的。
          日本最先推出的特異鱟試劑其商品名為Endospecy,其生產工藝的特點是將普通鱟試劑中存在的G因子,以親和層析方法分離去除。國內有人稱無(棄;去)G因子鱟試劑。顯然,鱟試劑中沒有G因子,即使被測樣品中存在真菌多糖(非內毒素),也不能產生活化的G因子,在反應旁路系統中就不能激活凝集酶原,旁路反應被阻斷,使成為對內毒素具有特異性。國內有人報道,以同樣方法制備了僅含C、B因子的鱟試劑。但是以這種工藝制備的特異鱟試劑,由于在分離G因子的過程中,必需防止帶入微量內毒素,即所用分離試劑、柱床、器皿及操作過程,嚴防內毒素污染,不僅增加了制備工藝的難度,也必然增加了鱟試劑的成本,因此很難推廣應用。
          1989年Berzofsty R N報道,在制備普通鱟試劑時,為了提高檢測內毒素的靈敏度,均采用氯仿提取存在于鱟試劑粗制品中的抗LPS(脂多糖)因子。氯仿提取的結果確實增加了鱟試劑的靈敏度,但同時將存在于鱟試劑粗制品中的抗G因子一同除去,這就使普通鱟試劑易被真菌多糖激活,增加了普通鱟試劑的非特異性。因此提出不用氯仿提取,改用一種特殊試劑(專利),只除去抗脂多糖因子,而保留抗G因子,以達到即增加了對內毒素的敏感性,又消弱了真菌多糖活化G因子的能力。這是從鱟試劑的生產工藝上進行改革,實現提供商品特異鱟試劑的一種方法。
          1990年Tsuchiya M報道,由于真菌多糖與普通鱟試劑反應形成凝膠,有一個特定濃度范圍(10-3-10-6mg/ml),大于或小于這個濃度都不能形成凝膠,故在制備普通鱟試劑的基礎上,加入過量的真菌多糖(1mg/ml),可阻止G因子的活化,即“封閉”了旁路,達到制備特異鱟試劑的目的。顯然采用這一措施制備的特異鱟試劑,較以上兩種方法即簡便又經濟,可使特異鱟試劑商品化。
    三、特異鱟試劑的應用
          內毒素是藥品污染熱原的主要原因,在GMP條件下生產藥品的熱原控制,無內毒素即無熱原,這是藥典普遍采用《細菌內毒素檢查法》代替《熱原檢查法》的依據。但是,某些藥品特別是血制品,由于其生產工藝中,一般需經過纖維素膜過濾,使污染Glucan樣物質的機會增加。藤原博等以普通鱟試劑和特異鱟試劑檢測商品血制劑(白蛋白、球蛋白)內毒素含量,并與熱原檢查結果比較,實驗表明,使用普通鱟試劑陽性檢出率高于特異鱟試劑,而后者的陽性檢出率與熱原檢查相符。同時作者向血制劑中添加內毒素后,再用兩種鱟試劑測定內毒素的含量,結果普通鱟試劑檢出量遠高于添加量,而特異鱟試劑檢出量與添加量基本一致。作者還以兩種鱟試劑檢測了精制吸附百白破三聯菌苗,并與家兔升溫曲線相比較,結果無大差別,說明精制吸附百白破三聯菌苗不像血液制品含樣β-Glucan物質,認為血液制品的內毒素檢測,使用特異鱟試劑可以與家兔熱原檢測得到十分一致的結果。Ikemura K等以普通和特異鱟試劑顯色基質法,定量測定經靜脈注射免疫球蛋白治療患者的血漿和尿中內毒素,血漿中鱟試驗反應物的含量隨給患者的免疫球蛋白量成比例增加,多次使用該反應物在血中累積,從尿中排出的量不足5%。該反應物很可能來自生產血制劑時使用了纖維素膜。作者認為,對接受免疫球蛋白患者進行血中內毒素測定時,對測定結果的解釋應給予特殊考慮。池屯勝美等對腎功能不全進行血透析患者的血中內毒素定量測定,使用普通鱟試劑顯色基質法經常出現陽性結果,但病人并未出現發熱和白細胞增加,經過對人工透析膜進行檢查,證明用銅銨人造絲膜有鱟試驗反應物游離,而用特異鱟試劑顯色基質法時,陽性檢出率很低,說明這些鱟試驗反應物不是內毒素,而是可以活化G因子的物質。由于中國特異鱟試劑不久即將商品化,目前應用報道廖廖,但筆者確信隨著細菌內毒素檢測工作的深入開展和對鱟試驗反應機理認識的深化,特異鱟試劑的應用將方興未艾。
     
    《藥物分析雜志》第17卷第5

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